二甲亞砜在-40、-50℃對關節(jié)軟骨滲出透特性的實驗研究
虞效益 張紹志 周正 陳光明
（浙江大學制冷與低溫研究所 杭州 310027）
摘要 玻璃化保存被認為是一種很有可能成功保存人體大型組織和器官的方法。為了在通常的急冷條件下達到玻璃化，需要添加高濃度的低溫保護劑（CPA）。0℃以上加載高濃度的CPA極可能會對細胞造成致命的毒性損傷，降低毒性損傷的一種有效方法是邊降溫邊提高CPA的濃度。本文實驗研究了-40、-50℃時二甲亞砜（Me2So）對綿羊關節(jié)軟骨的滲透性。把預滲一定濃度Me2So的軟骨片浸滲在-40、-50℃的Me2So的溶液中，經過不同時期間隔（5，15，30，60，120min）后取出軟骨組織，用分光光度法測量其中Me2So的含量。結果發(fā)現，在5min時軟骨里的Me2So含量下降，5min后才開始升高，濃度下降現象在-30℃及以上的實驗里未曾觀察到，這可能是粘度劇增帶來的濃度邊界層厚度變化的緣故。
關鍵詞 關節(jié)軟骨；玻璃化保存；二甲亞砜；滲透；低溫
0引言
玻璃化保存被認為是一種很有可能成功保存人體大型組織和器官的方法。通常，研究者采用添加混合低溫保護劑與快速冷卻相結合的方法來實現生物材料的玻璃化[1-4]。近年來，Pegg等人采用了一種名為“液相線跟蹤”的方法（Liquidus-tracking，LT）對綿羊關節(jié)軟骨實施了玻璃化保存，取得了良好的效果[5]，此法的降溫速率可以很慢，而且只使用了二甲亞砜（Me2So）一種低溫保護劑（CPA）。LT法依據CPA對生物材料的毒性隨溫度降低的特點，邊降溫邊提高CPA的濃度，從室溫直至-70℃。
雖然降低溫度可有效降低CPA對生物材料的毒性，但CPA的毒性還與時間有關，接觸時間過長同樣會對生物材料造成致命的損傷。因此，了解CPA對生物材料的滲透性對合理設計CPA的加載過程意義重大。對于關節(jié)軟骨，研究者已研究了多種CPA對其的滲透特性[6-9]，但所做研究都僅局限于0℃以上溫度位。而0℃以下CPA對關節(jié)軟骨的滲透特性對優(yōu)化LT法非常重要，目前國內外未見詳細報道。本文作者已對-10、-20、-30℃時，Me2So對綿羊關節(jié)軟骨的滲透特性進行了研究[10]，在研究-40、-50℃這兩個溫度位時發(fā)現了一個奇特的滲透現象，本文對此實驗過程進行了詳細描述并對這一奇特現象進行了初步解釋。
1材料與方法
1．1取材
軟骨取自于成年綿羊大腿關節(jié)處。綿羊于當地屠宰場屠宰后，取其關節(jié)囊用聚乙烯膜包好并置于放有冰袋的保溫箱中送達實驗室。取樣時，剖開關節(jié)囊，用角膜環(huán)鉆和手術刀從關節(jié)的負重部位切削下軟骨（直徑6mm，厚度0.6~1mm），并立即浸泡由Hepes緩部的平衡溶液（145mM Na+，3.3mM K+，20mM Hepes）中。
1．2實驗裝置
實驗裝置如圖1所示，實驗所需低溫（-40、-50℃）由一自行搭建的冷卻裝置提供。Me2So溶液的溫度用四線制鉑電陰溫度傳感器測量并在Agilent 34970A 數據采集單元上顯示。軟骨片浸滲在離心管中，離心管的底部及側壁均鉆有直徑為3mm的孔。離心管可一次性放置七個，均布于攪拌子周圍。
1．3標準曲線
配制濃度為18、24、30、36、42、48、54、60mg/L的Me2So標準溶液（所用Me2So為分析純，水為去離子水）待用。用紫外可見分光光度計（TU-1810PC，北京普析通用有限公司）于208nm處測量各標準溶液的吸光度，得到濃度（C）與吸光度（A）之間的線性關系：A=0.01089+0.01052C，R2=0.999.
1．4實驗過程
軟骨片隨機分成2組（-40、-50℃），詳細實驗設計如表1所示。每一組的浸滲時間為0、5、15、30、60和120min，每個時間含6片軟骨（n=6）。實驗具體損傷如下：1）把預先稱重的軟骨片于是2mL預平衡液中平衡：2）預平衡后取出軟骨片用Kimwipes®擦拭紙輕輕擦干，然后在去離子水中快速漂洗一次，再用擦拭紙輕輕擦干；3）浸滲于相應溫度和濃度的浸滲夜中，直至經過指定時間后取出；4）取出軟骨片，并用與步驟2相同的方法得理；5）放置于2mL的去離子水中，密封并于4℃冰箱冷藏室中過夜，使Me2So完全滲出至去離子水中；6）取0.3mL步驟5所得溶液（Me2So+去離子水）于50mL容量瓶中稀釋；7）用此外可見分光光度計于208nm處測量所得稀釋液的吸光度，由吸光度值可換算得到原先滲入到軟骨片中的Me2So的質量
表1實驗設計
Tab.1 Experimental design
組別 預平衡溫度 預平衡液濃度a 預平衡時間b 預平衡后軟骨中Me2So濃度c 浸滲溫度 浸滲液濃度
（℃） （%w/v） （min） （%w/v） （℃） （%w/v）
1 22 55.3 63 49.77 -40 69.8
2 22 60.2 68 54.18 -50 74.2
a. 假設浸滲達平衡時軟骨片中Me2So濃度平衡濃度的90%。
b. 預平衡所需時間由文獻[11]的結果保守估算得到。
c. 為了防止軟骨片在-40、-50℃凍結，軟骨片內Me2So的起始濃度根據文獻[12]中Me2So/NaC1/H2O三元溶注融點（Tm）與溶質濃度（S）的關系式計算得到，Tm=A·S+ B·S2+ C·S3,式中A=-0.6+0.17tan-1（R/2）132-0.001，C=-4.5×10-4，而R為Me2So與NaC1的質量比。計算時，把浸滲液看成Me2So/NaC1/H2O三元溶液。
軟骨中Me2So的濃度表示如下：（Me2So的質量/軟骨組織內溶液的體積）×100%，軟骨組織內溶液的體積近似為新鮮軟骨內水的體積，且忽略溫度的影響。新鮮軟骨的含水量為77.7%w/w[11]。
2結果與討論
-40、-50℃時，經過指定時間之后軟骨中Me2SO的濃度如表2所示。從表中數據可見，從0到5min，軟骨片中Me2SO的濃度不但沒有升高反而下降，5min之后才開始逐漸升高。經過120min的浸滲之后，軟骨片中的Me2SO的濃度分別為60.31±1.07%w/v和59.80±1.54%w/v，沒有達到平衡（假如由其它溫度為類推以軟骨片中Me2SO的濃度達到浸滲液濃度的90%作為浸滲平衡條件，則浸滲平衡濃度應分別為62.82%w/v和66.78%w/v）
表2經過指定時間之后軟骨片中Me2SO的濃度
Tab.2 The concentration of Me2SO in AC discs over various exposure times
浸滲溫度（℃） -40 -50
軟骨片中Me2SO濃度（%w/v）
時間（min）
0 50.64±0.46 54.08±1.21
5 49.31±0.42 52.19±2.23
15 50.50±1.32 55.44±1.90
30 53.34±1.25 57.61±1.85
60 57.59±1.04 59.10±1.51
120 60.31±1.07 59.80±1.54
圖2滲透奇特現象解釋簡圖
Fig.2 A schematic used for the explanation of the Anomalous permeation
軟骨片中Me2SO的濃度先下降然后才上升這一現象在-30℃及以上溫度位的實驗里未曾觀察到[10]。對于這一奇物現象，我們的解釋如下：
1）當浸滲達平衡時，組織內低溫保護劑（CPA）的濃度達不到浸滲液的濃度，這一現象已在多種組織中發(fā)現，包括關節(jié)軟骨[13]。造成這一結果的原因之一是組織內非溶劑水（不能溶解CPA）的存在，另外文獻[13]指出組織與浸滲液間存在壓力差（ΔP）也是原因之一。
2）由文獻[14]知，Me2SO/H2O二元溶液的粘度在-30℃與-45℃之間有一個激增。在Me2SO的摩爾分數為0.2~0.4的范圍內，-45℃時溶液的粘度是-30℃時的3.2倍左右。
根據上述依據（1），假設預平衡液的濃度為C2，預平衡之后軟骨片中Me2SO的濃度為C1，則C1< C2（如圖2（a）所示）。由依據（2），當把預平衡之后的軟骨片浸滲于溫度為-40或-50℃的浸滲液（假設濃度為C4）中時，軟骨表面的起始濃度并非瞬間由C1（C3）升至C4（浸滲液濃度），即C1= C3< C4（如圖2（b）所示）。另外，對于圖2（b）再根據（1），欲要維持軟骨片內Me2SO的濃度C1，則軟骨表面Me2SO的濃度需要達到至少C2，而現在只有C3，故軟骨片內Me2SO要向外滲出。當經過一定時間以后，假設軟骨片內Me2SO的濃度下降至C1’，而表面濃度各式至C3，此時可視為Me2SO從向外滲出轉為滲出入軟骨片內的轉折點。至此之后，Me2SO只會從浸滲液流向軟骨片內。
至于為什么在-30℃及以上溫度位未觀察到此種奇特現象，可能是由于在這些溫度位浸滲液的粘度還不是很大，致使軟骨表面的Me2SO濃度很快即上升為浸滲液的濃度（這一變化過程所需時間少于實驗所選取的時間間隔（5min）[10]）。
參考文獻
[1] Rall W F, Fahy G M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 by vitrification [J]. Nature,1985,313:573-575
[2] Song Y C,Khirabadi B S,Lightfoot F, et al. Vitreous cryopreservation maintains the function of vasular grafts [J].Nat Biotechnol,2000,18:296-299.
[3] Wusteman M C, Simmonds J, Vaughan D, et al. Vitrification of rabbit tissues with propylene glycol and trehalos [J]. Cryobiology,2008, 56:62-71.
[4] Xu H, Shi H C, Zang W F, et al. An experimental research on cryopreserving rabbit trachea by vitrification [J]. Cryobiology, 2009, 58:225-231.
[5] Pegg D E, Wang L H, Vaughan. Cryopreservation of articular cartilage. Part 3: The liquidus-tracking method [J]. Cryobiology, 2006, 52:360-368
[6] Mukherjee I N, Li Y Song Y C, et al.Cryoprotectant trasport through articular cartilage for long-term storage: experimental and modeling studies [J]. Osteoarthr Cartilage, 2008,16:1379-1386.
[7] sharma R, Law G K, Rehieh K, et al. A novel method to measure cryoprotectant permeation into intact articular cartilage [J]. Cryobiology, 2007, 54: 196-203.
[8] Jomha N M, Law G K, Abazari A, et al. Permeation of several cryoprotectant agents into porcine articular cartilage [J]. Cryobiology, 2009, 58: 110-114.
[9] Carsi B, Lopez-Lacomba J L, Sanz J, et al. Cryoprotectant permeation through human articular cartilage [J]. Osteoarthr Cartilage, 2004, 12:787-792.
[10] Zhang shaozhi, Yu xiaoyi, Chen guangming. Permeation of dimethyl sulfoxide into articular cartilage at subzero temperatures [J].（投搞中）
[11] 虞效益，張紹志，徐夢潔，等.二甲亞砜對關節(jié)軟骨滲透性研究發(fā)[J]。工程熱物理學報.（出版中）
[12] Pegg D E. Equations for botaining melting points and eutectic temperatures for the ternary system dimethyl sulphoxide/sodium chloride/water [J]. Cryo-Lett,1986, 7:387-394.
[13] Elmoazzen H Y, Elliott J A W, McGann L E. Cryoprotectant equilibration in tissues [J]. Cryobiology, 2005,51:85-91.
[14] Schichman S A, Amey R L. Viscosity and local liquid structure in dimethyl sulfoxide-water mixtures [J].J.Phys. Chem., 1971,75(1):98-102.
|
